线栓MCAO造模技术答疑

答：大鼠MCAO模型操作如下：

Jin R, Zhu X, Li G. Embolic middle cerebral artery occlusion (MCAO) for ischemic stroke with homologous blood clots in rats[J]. JoVE (Journal of Visualized Experiments), 2014 (91): e51956.

答：MCAO模型60-120min后，将线拴从颈内动脉向外拔出一段距离，使得颈总动脉的血液能够顺利回流到大脑中动脉中。造模后期线拴可以留在小鼠体内不做处理，但是要注意固定线拴的线头需要扎紧，避免出血。剪掉栓塞线多余部分，逐层缝合创口。

线栓在造模后期一般先用酒精消毒，避免可能的颅内感染。

答：老年鼠的判断标准：大鼠、小鼠的年龄在18-24个月以上。

如何控制体重在280g左右：饮食控制即可。280g可以控制每天摄食10-13g并随时监控。

目前对于老年鼠的研究：文献较多，研究类别也较丰富。由于小鼠寿命短，老年鼠易得，常用于研究衰老的起因和机理，神经细胞的凋亡规律，药物对学习和记忆功能、认知障碍的影响，抗衰老的作用，恢复老龄鼠的功能，包括神经干细胞增殖分化功能，以及一些免疫功能的研究。

老年鼠研究中的主要困难：饲养成本高，每一只老年鼠的饲养周期很长，购买费用高；在实验中，由于老年鼠的各器官已经老化，对老年鼠进行手术会导致死亡率高。

对老年鼠研究的建议：由于老年鼠的机能老化与人体许多功能很相似，建议多做老年鼠实验，尤其是老年鼠脑缺血模型的研究。

答：操作区域都是阻塞大脑中动脉。永久性缺血损伤是在脑缺血后不进行拔栓，而短暂性损伤在脑缺血60min，90min或者120min后有一个拔栓血液再灌注的过程。

判断标准：1）测脑血流：使用激光散斑血流成像系统测定小鼠两侧大脑的血流量。永久性损伤的缺血大脑血流不会恢复，比正常对侧要低很多。短暂性损伤的缺血大脑再灌注后血流能够恢复到对侧的80%左右。2）TTC染色：永久损伤的缺血性大脑损伤面积大，短暂性损伤的缺血性大脑损伤区域固定在皮层和纹状体之间。3）行为学：永久损伤的小鼠死亡率很好，行为学无法恢复。短暂性损伤的小鼠在缺血后期（14-28天）行为学能够在一定的程度上恢复正常。

答：1）麻醉：首先要保证小鼠的麻醉状态平稳，良好的开端是成功的第一步。所以需观测小鼠的呼吸如胸廓起伏程度保证麻醉程度合适。应监视心率，呼吸频率和体温这三项基本指标。麻醉期间至少每15 分钟记录一次以上参数。

正常监控参数：

①呼吸频率应为55-100 次呼吸/分钟；麻醉期间呼吸频率下降50％可能是正常的；呼吸模式可用于监测麻醉，应呼吸均匀平缓而不应深而慢或快而浅。

②脉搏频率应为300-500 次/分钟。

③麻醉下的正常温度范围为36.5°C 至37.5°C。

④粘膜颜色应为粉红色或鲜红色，不应为淡白色或深褐色。⑤正常的毛细管再填充时间（CRT）<2 秒。

2）手术操作：

分离颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉时一定要注意勿损伤迷走神经，并将血管周围的结缔组织剥离干净，为线栓插入做好准备。同时注意勿伤及血管以防止大出血导致死亡。颈总动脉上剪口是手术关键步骤之一，眼科剪要锐利，剪口时剪刀与血管正上方约成60°角，剪口不宜太大，否则血管容易断裂造成实验失败。以不超过颈总动脉壁上1/4为宜，但也不宜太小，否则入线困难。尼龙线栓的制备是MCAO手术中又一关键环节，线栓头端需修剪打磨圆钝，防止头端过于锋利而刺破血管，引发蛛网膜下腔出血而死亡。此外，线栓预先浸蘸肝素钠，一般认为可减少阻塞期间动脉血栓的形成。手术中，需尤其注意线栓连续缓慢推进时遇到轻微阻力即止，插线深度一般在18mm左右时可抵达大脑中动脉起始处或至大脑前动脉，线栓在血管内切忌顿挫式推进，否则可能由于无法体察轻微阻力而造成入线过深；当然也需防止因插线深度不足而导致线栓不能有效地阻断大脑中动脉血流。术后缝合时，需注意勿碰触线栓，因为线栓轻微外移有可能造成MCAO血流阻断失败。缺血结束后，在实施再灌注时，需注意回撤线栓一定要轻柔，切忌动作过猛或直接将线栓拔出而造成出血。另外还应注意术中对大鼠的保温，以及术后食物和水的供给。

3）线栓

①线栓制作：确定线栓包裹的大小直径，一般是6 号尼龙线，总长约1.5cm，硅胶头约2mm；线栓要均匀，捋直，不要大头，头重脚轻，不要太粗或太粗；线栓头部一定要先烧一下，圆润，否则易脱落和戳破。

②进栓过程：要确定线栓的进线深度，进线10mm 左右( 9.5-10.5 )， 太深会穿破分叉口进到更深的地方，戳破颈内里面的血管，太浅又无法达到阻塞的目的；只有正好在颈内颈外颈总动脉三叉口的部位才能完成中动脉的阻塞。进栓前线栓先用肝素浸泡处理，防止血流凝固造成阻塞。

成功率因操作者的熟练程度而异，一般在训练三个月后，成功率约为80%-85%。

答：原因：

a)     建立的模型不稳定，操作不规范；

b)    线栓头较小，无法完全导致大脑中动脉阻塞；

c)     线栓长度不足，没有达到中动脉处；

d)    TTC试剂使用次数过多。

避免出现问题：

a)     控制线拴头的大小，大约为2mm；

b)    27g-30g小鼠线拴的长度一般为9.5mm-10.5mm，260g-280g大鼠线拴的长度一般为18-19mm；

c)     需要使用多普勒血流仪实时监测脑血流，保证模型的稳定性。